La deficiencia de vitamina B12 (B12) es común entre las personas con diabetes mellitus, pero se desconoce si la deficiencia de B12 contribuye a la alteración de la homeostasis de la glucosa en este trastorno. Las ratas Sprague-Dawley fueron asignadas a una dieta de control o deficiencia de B12 durante 4 semanas. Las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal se realizaron después de 25 días y se recogieron muestras de sangre e hígado para el perfil metabólico. La deficiencia de B12 resultó en un fenotipo prediabético caracterizado por intolerancia a la glucosa, un pico retrasado en los niveles plasmáticos de insulina después de un desafío de glucosa y un aumento de la cetogénesis. Atribuimos el aumento de la cetogénesis a la reducción de la anaplerosis hepática, que limitó la disponibilidad de los intermedios del ciclo TCA citrato y succinato. Esto se asoció con un aumento de los niveles de ARNm Mut y la actividad de citrato sintasa y una menor disponibilidad de succinil-CoA. Los niveles de un metabolito de carbono se alteraron en el plasma y el hígado, lo que se vinculó a una capacidad de metilación reducida, niveles alterados de aminoácidos y una expresión elevada de ARNm de Slc7a5. Los niveles plasmáticos de folato y biotina se redujeron, al igual que la mayoría de las vitaminas B en el hígado. Los cambios en estos procesos dependientes de la B12 y la reducción de las cantidades de vitamina B probablemente contribuyeron a los déficits en el manejo de la glucosa. Nuestros hallazgos destacan que la deficiencia de B12 puede promover el desarrollo de trastornos metabólicos como la diabetes mellitus y enfatizar la importancia de una ingesta adecuada de B12 para la salud metabólica.